Nøkkelforskjell - PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er to viktige teknikker innen molekylærbiologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) er prosessen som skaper et stort antall kopier av et DNA-fragment. DNA-sekvensering er teknikken som resulterer i den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene til et gitt DNA-fragment. Dette er nøkkelforskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering. PCR er et av de viktigste trinnene i DNA-sekvensering.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er PCR
3. Hva er DNA-sekvensering
4. Sammenligning side om side - PCR vs DNA-sekvensering
5. Sammendrag
Hva er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en DNA-amplifikasjonsteknikk som brukes i molekylærbiologi. Den produserer tusenvis til millioner eksemplarer av et bestemt DNA-fragment. Denne metoden ble utviklet av Kary Mullis i 1983. I denne teknikken tjener fragmentet av DNA som skal amplifiseres som mal, og DNA-polymeraseenzym tilfører komplementære nukleotider til primeren som er tilgjengelig i PCR-blandingen. På slutten av PCR-reaksjonen syntetiseres mange kopier av prøve-DNA.
Det er forskjellige komponenter i PCR-blandingen, inkludert DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primere (primere forover og bakover), nukleotider (byggesteiner for DNA) og en buffer. PCR skjer inne i en PCR-maskin, og riktig PCR-blanding skal lastes inn i maskinen, og riktig program skal kjøres. Denne teknikken muliggjør produksjon av tusenvis til millioner eksemplarer av en bestemt del av DNA fra en veldig liten mengde DNA.
PCR-reaksjoner oppstår på en syklisk måte for å produsere den synlige mengden PCR-produkter på en gel. Det er tre hovedtrinn involvert i en PCR-reaksjon, nemlig denaturering, primerglødning og strengforlengelse som vist i figur 01. Disse tre trinnene forekommer ved tre forskjellige temperaturer. DNA eksisterer i dobbeltstrenget form ved hydrogenbindinger mellom de komplementære basene. Før implikasjon bør dobbeltstrenget DNA skilles fra hverandre. Det gjøres ved å gi høy temperatur. Ved høy temperatur dobbeltstrenget DNA-denaturering til enkle tråder. Deretter skal primerne komme nærmere de flankerende ender av det spesifikke fragmentet eller genet til DNA. Primer er et kort stykke enkeltstrenget DNA som er komplementært til målsekvensen. Primere forover og bakover glødes med de komplementære basene ved de flankerende ender av det denaturerte prøve-DNA ved glødetemperaturen. Grunning bør være varmebestandig. Når primere glødes med prøve-DNA, starter taq-polymeraseenzym syntesen av de nye strengene ved å tilsette nukleotider som er komplementære til mål-DNA. Taq polymerase er et varmestabilt enzym isolert fra en termofil bakterie kalt Thermus aquaticus. PCR-buffer opprettholder de optimale forholdene for taq-polymerase-handlingen. Disse tre stadiene av PCR-reaksjoner gjentas for å produsere den nødvendige mengden PCR-produkt. Etter hver PCR-reaksjon dobles antallet av DNA-kopien. Derfor kan en eksponensiell forsterkning observeres i PCR. PCR-produkter kan observeres ved bruk av gelelektroforese og kan renses for videre studier.
Figur 01: Viktigste trinn i en PCR-reaksjon
PCR er et verdifullt verktøy i medisinsk og biologisk forskning. PCR har en spesiell verdi innen rettsmedisinsk vitenskap, siden den kan forsterke DNA for studier fra de små prøvene fra kriminelle og lage rettsmedisinske DNA-profiler. PCR er mye brukt i mange områder av molekylærbiologi, inkludert genotyping, genkloning, mutasjonsdeteksjon, DNA-sekvensering, DNA-mikroarrays og farskapstesting, etc.
Figur 02: Polymerase kjedereaksjon
Hva er DNA-sekvensering?
DNA-sekvensering er bestemmelsen av en nøyaktig rekkefølge av nukleotidene - adenin, guanin, cytosin og tymin i et gitt DNA-fragment. Genetisk informasjon lagres i DNA-sekvensene ved å bruke riktig rekkefølge av nukleotidene. Derfor er det veldig viktig å vite om genenes struktur og funksjon å finne den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i et DNA-fragment.
DNA-sekvenseringsprotokoll involverer forskjellige prosesser. Det første trinnet er isolering av interessert DNA eller genomisk DNA fra en organisme. Ved bruk av PCR (som beskrevet ovenfor), bør den ønskede regionen av DNA amplifiseres. Forsterket PCR-produkt skal skilles fra gelelektroforese og renses. Forsterkede fragmenter blir servert som maler for sekvensering. Sekvensering kan gjøres enten etter Sanger-sekvensering eller metoden for sekvensering med høy gjennomstrømning. Sanger-sekvensering krever kapillærelektroforese av resulterende DNA-fragmenter. Bestemmelse av riktig nukleotidrekkefølge kan gjøres ved manuell lesing av autoradiografier eller ved bruk av automatiserte DNA-sekvenserere.
Gensekvensering bidro til Human genomprosjekt og lette kartleggingen av det menneskelige genomet i 2003. I rettsmedisin muliggjorde DNA-sekvensering identifikasjon av individer som viser unike DNA-sekvenser og identifiserer kriminelle. I medisin kan DNA-sekvensering brukes til å oppdage gener som er ansvarlige for genetiske og andre sykdommer, finne defektgener og erstatte dem med riktige gener. I landbruket brukes informasjon om DNA-sekvensering av noen mikroorganismer for å produsere transgene avlinger med økonomisk ønskede egenskaper.
Figur 03: DNA-sekvensering
Hva er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering?
Diff Article Middle before Table
PCR vs DNA-sekvensering |
|
| PCR-prosessen skaper tusenvis til millioner av eksemplarer av det interesserte DNA-fragmentet. | DNA-sekvensering er prosessen med å bestemme den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i et gitt DNA-fragment. |
| Utfall | |
| PCR lager tusenvis til millioner av kopier av et bestemt DNA-fragment | Dette resulterer i riktig rekkefølge av basene i et bestemt DNA-fragment. |
| Involvering av ddNTP | |
| PCR krever ikke ddNTPer. Den bruker dNTPer. | DNA-sekvensering krever ddNTPer for å avslutte strengdannelse. |
Sammendrag - PCR vs DNA-sekvensering
PCR og DNA-sekvensering er veldig viktige verktøy i mange områder av molekylærbiologi. Amplifisering av DNA-fragmentene gjøres ved hjelp av PCR-teknikken, mens riktig rekkefølge av nukleotidene til et DNA-fragment bestemmes av DNA-sekvenseringen. Dette er forskjellen mellom PCR og DNA-sekvensering.
