Nøkkelforskjell - PCR Primers vs Sequencing Primers
Med den nylige utviklingen innen molekylærbiologi ble det utviklet forskjellige genetiske teknikker som gjorde undersøkelsesprosessene i forskjellige veier av emnet enkle og nøyaktige. PCR og andre sekvenseringsprosedyrer er to viktige slike teknikker. De bruker forskjellige underkomponenter. Primere regnes som den viktigste underkomponenten som er felles for både PCR og sekvenseringsteknikker. PCR-primere brukes til amplifikasjon av en bestemt DNA-sekvens mens sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dens spesifikke rekkefølge av nukleotidsekvensen. Dette er nøkkelforskjellen mellom PCR-primere og sekvenseringsprimere.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er PCR-primere
3. Hva er sekvenseringsgrunning
4. Likheter mellom PCR-primere og sekvenseringsgrunning
5. Sammenligning side om side - PCR-primere vs sekvenseringsgrunning i tabellform
6. Sammendrag
Hva er PCR Primers?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en genetisk teknikk som brukes innen molekylærbiologi for å forsterke en enkelt eller få kopier av et bestemt DNA-segment og for å oppnå mange millioner identiske kopier. I en PCR-reaksjon brukes forskjellige komponenter inkludert primere. Primere er korte DNA-tråder med en nukleotidlengde på 18-25, noe som gjør dem kompatible med start- og sluttområdet til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. Grunning kan være en primer og revers grunning. Disse primerne binder seg til DNA-fragmentet på de spesifikke punktene der det lager DNA-polymerase for å binde seg til den spesifikke primeren på stedet og initiere syntesen av den nye DNA-strengen.
Valget av primere er et viktig aspekt av PCR-prosessen. Valget av primerens lengde er viktig. Den ideelle lengden ville være 18-25 nukleotider. Hvis lengden er for kort eller for lang, vil ikke primerne binde seg til DNA-sekvensen som skal amplifiseres nøyaktig. Primere som er for korte i lengde fører til ikke-spesifikk primerglødning på forskjellige steder i DNA-sekvensen.
Figur 01: PCR-grunning
Guanin- og cytosininnholdet (GC) i en god primer bør være i området 40-60. Primerglødningstemperaturen og smeltetemperaturen er viktige faktorer under PCR. Smeltetemperaturen bør beregnes nøyaktig, og grunnglødningstemperaturen skal være 5 0 C lavere enn smeltetemperaturen. Smeltetemperaturen skal være 60 ° C og 75 ° C. For høye eller for lave temperaturer vil resultere i mindre aktiv DNA-polymeraseaktivitet.
Hva er Sequencing Primers?
Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. For å oppnå gode sekvenseringsresultater er primere og maler av høy kvalitet viktig. Når primere velges, bør de derfor være unike for en bestemt region der vi ønsker å sekvensere. Det bør også være med riktig retning der sekvensene vanligvis genereres fra 3 'til 5' ender av primerne. Sekvensen bør mangle uønsket selvhybridisering, slik som dannelsen av hårnålssløkker. Den skal ikke inneholde sammenhengende dannelse av Guanine-baser.
Grunningens smeltetemperatur (Tm) må være egnet for forholdene til sekvenseringen. Derfor bør den ligge mellom 52 ° C og 74 ° C. Fremstilling av oligonukleotider som skal brukes som en primer, bør renses for å oppnå ønsket full lengde på sekvensen. Hvis oligonukleotidene inneholder urenheter, vil primersekvenssignaliseringen bli overlagret fra forskjellige primingseter, og det vil også redusere antall baseceller.
Figur 02: Sekvenseringsgrunning
Primersmeltetemperaturen (Tm) til et oligonukleotid bestemmer hvor sterke de komplementære DNA-strengene hybridiseres med hverandre. Tm kan betraktes som en termodynamisk beregning der den er avhengig av både DNA-sekvenser og flere forhold som saltkonsentrasjon. Tm er viktig under PCR der en variant kalt syklus sekvensering brukes til å produsere en gruppe dideoxynukleotid-avsluttede fragmenter. Her vil primeren som er sekvensert i utgangspunktet annealeres alternativt, deretter utvides og til sist denaturert for forsterkning. Derfor bør Tm-verdien være mellom 52 o C og 74 oC. Syntetiserte oligonukleotider kan fås fra DNA / RNA-synteselaboratorier etter valg. Den lille synteseskalaen som brukes til DNA-sekvensering er vanligvis 50 nmol. Det viktigste er også at primerne som brukes til sekvensering, bør renses for å være fri for urenheter som vil forhindre kvalitetsreduksjon.
Hva er likhetene mellom PCR-grunning og sekvenseringsgrunning?
- Både PCR Primers og Sequencing Primers er primere som brukes i amplifikasjonsprosessen til en målrettet DNA-sekvens.
- Både PCR Primers og Sequencing Primers er sammensatt av nukleotider.
- Både PCR Primers og Sequencing Primers er korte oligomerer.
Hva er forskjellen mellom PCR Primers og Sequencing Primers?
Diff Article Midt før tabell
PCR Primers vs Sequencing Primers |
|
| PCR-primere er korte DNA-tråder med en nukleotidsekvenslengde på 18-25, noe som gjør dem kompatible med start- og sluttregionen til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. | Sekvenseringsprimere er korte oligomerer som brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. |
| Funksjon | |
| PCR-primere brukes til amplifikasjon av en bestemt DNA-sekvens. | Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. |
| Antall primere som trengs | |
| To primere; en fremover primer og en omvendt primer brukes som PCR primere. | Trenger bare en primer som sekvenseringsgrunning. |
Sammendrag - PCR Primers vs Sequencing Primers
Sekvenseringsprimere brukes i sammenheng med sekvensering av et DNA-fragment med den hensikt å avsløre dets spesifikke identitet. En sekvenseringsgrunning vil være nok til å kjøre prosessen. For å oppnå gode sekvenseringsresultater er primere og maler av høy kvalitet viktig. Når primere velges, bør de derfor være unike for en bestemt region der vi ønsker å sekvensere. PCR-primere er korte DNA-tråder med en nukleotidlengde på 18-25 som er kompatibel med start- og sluttregionen til DNA-fragmentene som skal amplifiseres. PCR-primere kan være en primer og revers primer. Guanin- og cytosininnholdet (GC) i en god grunning bør være i området 40-60. Primerglødningstemperaturen og smeltetemperaturen er viktige aspekter under PCR. Dette er forskjellen mellom PCR-primere og Sequencing-primere.
