Nøkkelforskjell - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nukleotider er de grunnleggende strukturelle enhetene og byggesteinene i DNA. DNA-molekylet er sammensatt av en polynukleotidkjede. Det er fire forskjellige nukleotider som finnes i DNA. Disse nukleotidene er sammensatt av fire forskjellige nitrogenholdige baser kalt A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (tymin). Rekkefølgen av nukleotidene i DNA-molekylet har stor betydning, da den koder for viktig genetisk informasjon for vekst og utvikling av organismer. DNA-sekvensering refererer til prosessen som bestemmer den nøyaktige nukleotidsekvensen til DNA. Det er forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder. Maxam Gilbert-sekvensering og Sanger DNA-sekvensering er to metoder for DNA-sekvensering som tilhører første generasjons sekvensering. Maxam Gilbert-sekvenseringsprosedyre bestemmer basesekvensen ved å kjemisk spalte 5'-endemerkede DNA-fragmenter fortrinnsvis ved hver av fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekvenseringsprosedyre bestemmer nukleotidsekvensen ved å syntetisere enkeltstrenget DNA ved hjelp av DNA-polymerase og dideoxynukleotider og gelelektroforese. Dette er nøkkelforskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Maxam Gilbert
3. Hva er Sanger-sekvensering
4. Sammenligning ved siden av hverandre - Maxam Gilbert vs Sanger-sekvensering
5. Sammendrag
Hva er Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-sekvensering, også kjent som kjemisk sekvenseringsmetode, er en teknikk som ble utviklet for å bestemme rekkefølgen av nukleotidene i DNA. Denne metoden ble introdusert av Walter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og ble populær siden den kan utføres direkte med renset DNA. Maxam Gilbert-metoden tilhører den første generasjonen av DNA-sekvensering, og det var den første sekvenseringsmetoden som ble brukt mye av forskere.
Det grunnleggende prinsippet for denne metoden ligger i begrensningen av de endemerkede DNA-fragmentene ved spesifikke baser av basespesifikke kjemikalier og betingelser og separasjon av de merkede fragmentene ved elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter er skilt i henhold til deres størrelse på gel. Siden fragmentene er merket, kan sekvensen til DNA-molekylet lett utledes.
Maxam gilbert-metoden bruker basisspesifikke kjemikalier for å bryte DNA på bestemte baser. To vanlige kjemikalier kalt dimetylsulfat og hydrazin kjemikalier brukes til å angripe henholdsvis puriner og pyrimidiner.
Maxam Gilbert sekvenseringsmetode utføres via flere trinn som følger.
- Rensing av DNA-sekvensen ved bruk av restriksjonsendonukleaser
- Merking av endene av DNA-fragmentene ved tilsetning av radioaktive fosfater
- Rensing av de merkede fragmentene fra ikke-merkede fragmenter ved gelelektroforese
- Separasjon av det endemerkede DNA i fire rør og behandling med basespesifikke kjemikalier separat
- Elektroforese av innholdet i hvert rør på separate linjer på en gel og fragment separasjon i henhold til deres lengde.
- Påvisning av fragmentene ved hjelp av autoradiograph.
Figur 01: Maxam Gilbert sekvensering
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme basesekvensen til et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjedetermineringssekvensering eller Dideoxy-sekvenseringsmetode. Denne metoden fungerer på prinsippet om selektiv inkorporering av kjedeavslutende dideoxynukleotider (ddNTPs) som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP av DNA-polymerase under syntesen av enkeltstrenget DNA for å avslutte dannelse av streng. Dideoxynukleotider mangler 3'OH-grupper for dannelse av fosfodiesterbindinger med tilstøtende nukleotid. Derfor stopper strengformasjonen når en ddNTP er innlemmet i nydannende streng under sanger-sekvensering.
I denne metoden utføres fire separate DNA-syntesereaksjoner (PCR) i fire separate rør med en type ddNTP. Andre krav er også gitt for rør for PCR inkludert primere, dNTP, Taq-polymerase, spesifikke forhold, etc. Fire separate reaksjoner utføres i fire rør med fire blandinger. Etter PCR-reaksjoner blir resulterende DNA-fragmenter denaturert og separert ved gelelektroforese. Deretter visualiseres fragmentene ved å bruke enten en merket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP som vist i figur 02.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Hva er forskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?
Diff Article Middle before Table
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sekvensering er den første teknikken som er utviklet for DNA-sekvensering. | Sanger-sekvenseringsmetoden ble introdusert etter Maxam Gilbert-sekvenseringsmetoden. |
| Bruk | |
| Denne metoden brukes sjelden. | Sanger-sekvensering brukes rutinemessig til sekvensering. |
| Bruk av farlige kjemikalier | |
| Den bruker farlige kjemikalier. | Bruk av farlige kjemikalier er begrenset sammenlignet med Maxam Gilbert-metoden. |
| Merking for påvisning | |
| Denne metoden bruker radioaktivt P 32 for merking av endene av DNA-fragmentene. | Sanger-sekvensering bruker radioaktivt eller fluorescerende merkede ddNTPer. |
Sammendrag - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert og Sanger-sekvensering er to typer DNA-sekvenseringsteknikker som kommer inn under første generasjons DNA-sekvensering. Maxam Gilbert-sekvensering er den første metoden som ble introdusert for DNA-sekvensering i 1976, og den utføres ved å bryte de endemerkede DNA-fragmentene av basespesifikke kjemikalier. Derfor er det kjent som kjemisk sekvensering. Sanger-sekvenseringsmetoden ble introdusert i 1977, og er basert på ddNTP-drevne kjedeavslutningsreaksjoner. Sanger-sekvenseringsmetode populær enn Maxam Gilbert-metoden på grunn av flere ulemper ved Maxam Gilbert-metoden, som for mye tidsforbruk, bruk av farlige kjemikalier, etc. Dette er forskjellen mellom Maxam Gilbert og Sanger-sekvensering.
