Forskjellen Mellom NGS Og Sanger Sequencing

2024 Forfatter: Mildred Bawerman | [email protected]. Sist endret: 2023-12-16 08:41

Nøkkelforskjell - NGS vs Sanger Sequencing

Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekvenseringsteknikker utviklet over tid. Sanger Sequencing-metoden ble mye brukt i mange år, og NGS erstattet den nylig på grunn av fordelene. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger-sekvensering er at NGS fungerer på prinsippet om å sekvensere millioner av sekvenser samtidig på en rask måte gjennom et sekvenseringssystem mens Sanger-sekvensering fungerer på prinsippet om kjedeterminering på grunn av selektiv inkorporering av dideoxynukleotider av DNA-polymeraseenzym under DNA-replikering og resulterende fragment separasjon ved kapillær elektroforese.

INNHOLD

1. Oversikt og nøkkelforskjell

2. Hva er nukleotidsekvensering

3. Hva er NGS

4. Hva er Sanger-sekvensering

5. Sammenligning side om side - NGS vs Sanger-sekvensering

6. Sammendrag

Hva er nukleotidsekvensering?

Genetisk informasjon lagres i nukleotidsekvensene til DNA eller RNA i en organisme. Prosessen med å bestemme riktig rekkefølge av nukleotider (ved bruk av fire baser) i et gitt fragment (i et gen, en klynge av gener, kromosom og komplett genom) er kjent som nukleotidsekvensering. Det er veldig viktig i genomiske studier, rettsmedisinske studier, virologi, biologisk systematisk, medisinsk diagnose, bioteknologi og i mange andre felt å analysere strukturen og funksjonen til gener. Det er forskjellige typer sekvenseringsmetoder utviklet av forskere. Blant dem ble Sanger-sekvensering utviklet av Frederick Sanger i 1977 mye brukt og popularisert i lang tid til Next Generation Sequencing erstattet den.

Hva er NGS?

Next Generation Sequencing (NGS) er et begrep som brukes til å referere til moderne sekvenseringsprosesser med høy gjennomstrømning. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier som revolusjonerte genomstudier og molekylærbiologi. Disse teknikkene er Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, Ion Proton-sekvensering og SOLiD (sekvensering ved Oligo ligeringsdeteksjon) sekvensering. NGS-systemer er raskere og billigere. Fire hoved-DNA-sekvenseringsmetoder brukes i NGS-systemer, nemlig; pyrosekvensering, sekvensering ved syntese, sekvensering ved ligering og ion halvledersekvensering. Et stort antall DNA- eller RNA-tråder (millioner av) kan sekvenseres parallelt. Det tillater sekvensering av hele genomet i organismer i løpet av en kort tidsperiode, i motsetning til Sanger-sekvensering som tar mer tid.

NGS har mange fordeler i forhold til konvensjonell Sanger-metode. Det er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess som kan utføres med en liten prøvestørrelse. NGS kan brukes i metagenomiske studier, i påvisning av variasjoner i et individuelt genom på grunn av innsettinger og delesjoner etc. og i analysen av genuttrykk.

Figur_1: Utvikling i NGS-sekvensering

Hva er Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjedeavslutningssekvensering eller Dideoxy-sekvensering. Arbeidsprinsippet for denne metoden er avslutning av strengsyntese ved selektiv inkorporering av en kjede som avslutter dideoxynukleotider (ddNTPs) slik som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP av DNA-polymerase under replikering av DNA. Normale nukleotider har 3 'OH-grupper for dannelse av en fosfodiesterbinding mellom tilstøtende nukleotider for å fortsette strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTPs denne 3'-OH-gruppen og er ikke i stand til å danne fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Derfor opphører kjedeforlengelsen.

I denne metoden tjener det enkeltstrengede DNA som skal sekvenseres som malstreng for in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidgrunning, deoksynukleotidforløpere og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender av målfragmentet er kjent, kan primere lett utformes for DNA-replikasjon. Fire separate DNA-syntesereaksjoner utføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTPer, sammen med andre krav. Fra det spesifikke nukleotidet tilsettes en blanding av dNTP og ddNTP. På samme måte utføres fire separate reaksjoner i fire rør med fire blandinger. Etter reaksjonene utføres påvisning av DNA-fragmenter og konvertering av fragmentmønsteret til sekvensinformasjon. Resulterende DNA-fragmenter blir varmedenaturert og separert ved gelelektroforese. Hvis radioaktive nukleotider brukes, kan båndmønsteret i polyakrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metoden bruker de fluorescerende merkede dideoxynukleotidene, kan den dempes nedover i gelen og sendes gjennom en laserstråle som detekteres av den fluorescerende detektoren. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen.

Dette er metoden som brukes til å sekvensere DNA fra Human Genome-prosjektet. Denne metoden er fortsatt i bruk med avanserte modifikasjoner fordi den gir nøyaktig sekvensinformasjon til tross for at den er en kostbar og langsom prosess.

Figur_2: Sanger-sekvensering

Hva er forskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing?

Diff Article Middle before Table

NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) refererer til moderne sekvenseringsprosesser med høy gjennomstrømning. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier	Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment.
Kostnadseffektivitet
NGS er en billigere prosess fordi den reduserer tid, menneskekraft og kjemikalier.	Dette er en kostbar prosess fordi det tar tid, menneskekraft og flere kjemikalier.
Hastighet
Dette er raskere siden både kjemisk deteksjon og signaldeteksjon av mange tråder skjer parallelt.	Dette er tidkrevende siden kjemisk deteksjon og signaldeteksjon skjer som to separate prosesser og bare på streng kan lese om gangen.
Pålitelighet
NGS er pålitelig.	Sanger sekvensering er mindre pålitelig
Prøvestørrelse
NGS krever mindre mengde DNA.	Denne metoden trenger en stor mengde mal-DNA.
DNA-baser per sekvensert fragment
Antall DNA-baser per sekvensert fragment er lavere enn Sanger-metoden	Genererende sekvenser er lengre enn NGS-sekvenser.

Sammendrag - NGS vs Sanger Sequencing

NGS og Sanger Sequencing er nukleotidsekvenseringsteknikker som er mye brukt i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering er en tidlig sekvenseringsmetode som ble erstattet av NGS. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er at NGS er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess enn Sanger-sekvensering. Begge teknikkene skapte store utbrudd innen genetikk og bioteknologi.