Nøkkelforskjell - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekvenseringsteknikker utviklet over tid. Sanger Sequencing-metoden ble mye brukt i mange år, og NGS erstattet den nylig på grunn av fordelene. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger-sekvensering er at NGS fungerer på prinsippet om å sekvensere millioner av sekvenser samtidig på en rask måte gjennom et sekvenseringssystem mens Sanger-sekvensering fungerer på prinsippet om kjedeterminering på grunn av selektiv inkorporering av dideoxynukleotider av DNA-polymeraseenzym under DNA-replikering og resulterende fragment separasjon ved kapillær elektroforese.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er nukleotidsekvensering
3. Hva er NGS
4. Hva er Sanger-sekvensering
5. Sammenligning side om side - NGS vs Sanger-sekvensering
6. Sammendrag
Hva er nukleotidsekvensering?
Genetisk informasjon lagres i nukleotidsekvensene til DNA eller RNA i en organisme. Prosessen med å bestemme riktig rekkefølge av nukleotider (ved bruk av fire baser) i et gitt fragment (i et gen, en klynge av gener, kromosom og komplett genom) er kjent som nukleotidsekvensering. Det er veldig viktig i genomiske studier, rettsmedisinske studier, virologi, biologisk systematisk, medisinsk diagnose, bioteknologi og i mange andre felt å analysere strukturen og funksjonen til gener. Det er forskjellige typer sekvenseringsmetoder utviklet av forskere. Blant dem ble Sanger-sekvensering utviklet av Frederick Sanger i 1977 mye brukt og popularisert i lang tid til Next Generation Sequencing erstattet den.
Hva er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et begrep som brukes til å referere til moderne sekvenseringsprosesser med høy gjennomstrømning. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier som revolusjonerte genomstudier og molekylærbiologi. Disse teknikkene er Illumina-sekvensering, Roche 454-sekvensering, Ion Proton-sekvensering og SOLiD (sekvensering ved Oligo ligeringsdeteksjon) sekvensering. NGS-systemer er raskere og billigere. Fire hoved-DNA-sekvenseringsmetoder brukes i NGS-systemer, nemlig; pyrosekvensering, sekvensering ved syntese, sekvensering ved ligering og ion halvledersekvensering. Et stort antall DNA- eller RNA-tråder (millioner av) kan sekvenseres parallelt. Det tillater sekvensering av hele genomet i organismer i løpet av en kort tidsperiode, i motsetning til Sanger-sekvensering som tar mer tid.
NGS har mange fordeler i forhold til konvensjonell Sanger-metode. Det er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess som kan utføres med en liten prøvestørrelse. NGS kan brukes i metagenomiske studier, i påvisning av variasjoner i et individuelt genom på grunn av innsettinger og delesjoner etc. og i analysen av genuttrykk.
Figur_1: Utvikling i NGS-sekvensering
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment. Det er også kjent som kjedeavslutningssekvensering eller Dideoxy-sekvensering. Arbeidsprinsippet for denne metoden er avslutning av strengsyntese ved selektiv inkorporering av en kjede som avslutter dideoxynukleotider (ddNTPs) slik som ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP av DNA-polymerase under replikering av DNA. Normale nukleotider har 3 'OH-grupper for dannelse av en fosfodiesterbinding mellom tilstøtende nukleotider for å fortsette strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTPs denne 3'-OH-gruppen og er ikke i stand til å danne fosfodiesterbindinger mellom nukleotider. Derfor opphører kjedeforlengelsen.
I denne metoden tjener det enkeltstrengede DNA som skal sekvenseres som malstreng for in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidgrunning, deoksynukleotidforløpere og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender av målfragmentet er kjent, kan primere lett utformes for DNA-replikasjon. Fire separate DNA-syntesereaksjoner utføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTPer, sammen med andre krav. Fra det spesifikke nukleotidet tilsettes en blanding av dNTP og ddNTP. På samme måte utføres fire separate reaksjoner i fire rør med fire blandinger. Etter reaksjonene utføres påvisning av DNA-fragmenter og konvertering av fragmentmønsteret til sekvensinformasjon. Resulterende DNA-fragmenter blir varmedenaturert og separert ved gelelektroforese. Hvis radioaktive nukleotider brukes, kan båndmønsteret i polyakrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metoden bruker de fluorescerende merkede dideoxynukleotidene, kan den dempes nedover i gelen og sendes gjennom en laserstråle som detekteres av den fluorescerende detektoren. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen. For å unngå feil som kan oppstå når en sekvens leses av øyet og angis manuelt i en datamaskin, utviklet denne metoden seg til bruk av automatisert sequencer kombinert med datamaskinen.
Dette er metoden som brukes til å sekvensere DNA fra Human Genome-prosjektet. Denne metoden er fortsatt i bruk med avanserte modifikasjoner fordi den gir nøyaktig sekvensinformasjon til tross for at den er en kostbar og langsom prosess.
Figur_2: Sanger-sekvensering
Hva er forskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing?
Diff Article Middle before Table
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) refererer til moderne sekvenseringsprosesser med høy gjennomstrømning. Den beskriver en rekke forskjellige moderne sekvenseringsteknologier | Sanger Sequencing er en sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger for å bestemme den nøyaktige nukleotidrekkefølgen til et gitt DNA-fragment. |
| Kostnadseffektivitet | |
| NGS er en billigere prosess fordi den reduserer tid, menneskekraft og kjemikalier. | Dette er en kostbar prosess fordi det tar tid, menneskekraft og flere kjemikalier. |
| Hastighet | |
| Dette er raskere siden både kjemisk deteksjon og signaldeteksjon av mange tråder skjer parallelt. | Dette er tidkrevende siden kjemisk deteksjon og signaldeteksjon skjer som to separate prosesser og bare på streng kan lese om gangen. |
| Pålitelighet | |
| NGS er pålitelig. | Sanger sekvensering er mindre pålitelig |
| Prøvestørrelse | |
| NGS krever mindre mengde DNA. | Denne metoden trenger en stor mengde mal-DNA. |
| DNA-baser per sekvensert fragment | |
| Antall DNA-baser per sekvensert fragment er lavere enn Sanger-metoden | Genererende sekvenser er lengre enn NGS-sekvenser. |
Sammendrag - NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger Sequencing er nukleotidsekvenseringsteknikker som er mye brukt i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering er en tidlig sekvenseringsmetode som ble erstattet av NGS. Hovedforskjellen mellom NGS og Sanger Sequencing er at NGS er en høyhastighets, mer nøyaktig og kostnadseffektiv prosess enn Sanger-sekvensering. Begge teknikkene skapte store utbrudd innen genetikk og bioteknologi.
