Nøkkelforskjell - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA-sekvensering er veldig viktig for DNA-analyse, siden kunnskap om riktig nukleotidarrangement på en bestemt DNA-region avslører mange viktige opplysninger om den. Det er forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder. Sanger-sekvensering og pyrosekvensering er to forskjellige DNA-sekvenseringsmetoder som er mye brukt i molekylærbiologi. Hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og pyrosekvensering er at Sanger-sekvensering bruker dideoxynukleotider for å avslutte syntesen av DNA for å lese nukleotidsekvensen mens pyrosekvensering oppdager pyrofosfatfrigjøringen ved å inkorporere nukleotidene og syntetisere den komplementære sekvensen for å lese den nøyaktige rekkefølgen av sekvensen.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Sanger-sekvensering
3. Hva er pyrosekvensering
4. Sammenligning ved siden av hverandre - Sanger-sekvensering vs Pyrosekvensering
5. Sammendrag
Hva er Sanger Sequencing?
Sanger-sekvensering er en første generasjons DNA-sekvenseringsmetode utviklet av Frederick Sanger og hans høyskoler i 1977. Den er også kjent som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekvensering siden den er basert på kjedeavslutning av dideoxynukleotider (ddNTPs). Denne metoden ble mye brukt i mer enn 30 år til New Generation Sequencing (NGS) ble utviklet. Sanger-sekvenseringsteknikk muliggjorde oppdagelsen av riktig nukleotidrekkefølge eller feste av et bestemt DNA-fragment. Den er basert på selektiv inkorporering av ddNTP og avslutning av DNA-syntese under in vitro DNA-replikasjon. Fraværet av 3'OH-grupper for å fortsette dannelsen av fosfodiesterbindinger mellom tilstøtende nukleotider er et unikt trekk ved ddNTP. Derfor, når ddNTP er festet, opphører kjedeforlengelsen og slutter fra det punktet. Det er fire ddNTPer - ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP - brukt i Sanger-sekvensering. Disse nukleotidene stopper DNA-replikasjonsprosessen når de blir innlemmet i den voksende DNA-strengen og resulterer i varierende lengder på kort DNA. Kapillærgelelektroforese brukes til å organisere disse korte DNA-strengene etter størrelse på en gel som vist i figur 01.
Figur 1: kapillærgelelektroforese av syntetisert kort DNA
For in vitro-replikering av DNA, bør det stilles få krav. De er DNA-polymeraseenzym, mal-DNA, oligonukleotidprimere og deoksynukleotider (dNTP). I Sanger-sekvensering utføres DNA-replikasjon i fire separate prøverør sammen med fire typer ddNTPs hver for seg. Deoksynukleotider erstattes ikke helt av de respektive ddNTP-ene. En blanding av det spesifikke dNTP (for eksempel; dATP + ddATP) er inkludert i røret og replikert. Fire separate rørprodukter kjøres på en gel i fire separate brønner. Deretter kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02 ved å lese gelen.
Figur 02: Sanger-sekvensering
Sanger sekvensering er en viktig teknikk som hjelper på mange områder av molekylærbiologi. Human genomprosjekt ble vellykket gjennomført ved hjelp av Sanger sekvenseringsbaserte metoder. Sanger-sekvensering er også nyttig i mål-DNA-sekvensering, kreft- og genetisk sykdomsforskning, genekspresjonsanalyse, menneskelig identifikasjon, patogen deteksjon, mikrobiell sekvensering etc.
Det er flere ulemper med Sanger-sekvensering:
- Lengden på DNA som blir sekvensert kan ikke være lengre enn 1000 basepar
- Bare en streng kan sekvenseres om gangen.
- Prosessen er tidkrevende og kostbar.
Derfor ble det utviklet nye avanserte sekvenseringsteknikker med tiden for å overvinne disse problemene. Imidlertid er Sanger-sekvensering fortsatt i bruk på grunn av de svært nøyaktige resultatene opp til omtrent 850 baselagfragmenter.
Hva er Pyrosequencing?
Pyrosekvensering er en ny DNA-sekvenseringsteknikk basert på "sekvensering ved syntese". Denne teknikken er avhengig av påvisning av pyrofosfatfrigjøring ved nukleotidinnlemmelsen. Prosessen benyttes av fire forskjellige enzymer: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin 5 'fosfosulfat (APS) og luciferin.
Prosessen starter med primerbinding med den enkeltstrengede DNA-malen, og DNA-polymerase starter inkorporering av nukleotider som er komplementære til den. Når nukleotidene slår seg sammen (nukleinsyrepolymerisasjon) frigjør det pyrofosfat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidtilsetning frigjør ekvimolær mengde pyrofosfat. Pyrofosfat konverteres til ATP av ATP-sulfurylase i nærvær av substrat APS. Den genererte ATP driver den luciferase-formidlede konvertering av luciferin til oksyluciferin, og produserer synlig lys i mengder som er proporsjonale med mengden ATP. Lys oppdages av en fotonoppdagelsesenhet eller av fotomultiplikator og skaper et pyrogram. Apyrase nedbryter ATP og ikke-innlemmede dNTP i reaksjonsblandingen. dNTP-tillegg gjøres en gang om gangen. Siden tilsetning av nukleotid er kjent i henhold til inkorporering og påvisning av lys, kan sekvensen til malen bestemmes. Pyrogram brukes til å generere nukleotidsekvensen til prøve-DNA som vist i figur 03.
Pyrosekvensering er veldig viktig i enkel nukleotid polymorfisme analyse og sekvensering av korte DNA-strekninger. Den høye nøyaktigheten, fleksibiliteten, enkel automatisering og parallelle prosessering er fordelene med pyrosekvensering fremfor Sanger-sekvenseringsteknikker.
Figur 03: Pyrosekvensering
Hva er forskjellen mellom Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
Diff Article Middle before Table
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger-sekvensering er en DNA-sekvenseringsmetode basert på selektiv inkorporering av ddNTP ved DNA-polymerase og kjedeterminering. | Pyrosekvensering er en DNA-sekvenseringsmetode basert på påvisning av pyrofosfatfrigjøring ved inkorporering av nukleotid. |
| Bruk av ddNTP | |
| ddNTP brukes til å avslutte DNA-replikasjonen | ddNTP brukes ikke. |
| Enzymer involvert | |
| DNA-polymerase brukes. | Fire enzymer brukes: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase og Apyrase. |
| Underlag brukt | |
| APS og Luciferin brukes ikke. | Adenosin 5 'fosfosulfat (APS) og luciferin brukes. |
| Maksimal temperatur | |
| Dette er en langsom prosess. | Dette er en rask prosess. |
Sammendrag - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekvensering og pyrosekvensering er to DNA-sekvenseringsmetoder som brukes i molekylærbiologi. Sanger-sekvensering konstruerer rekkefølgen av nukleotidene i sekvens ved å avslutte kjedeforlengelsen, mens pyrosekvenseringen konstruerer den nøyaktige rekkefølgen av nukleotidene i sekvens ved inkorporering av nukleotider og påvisning av frigjøring av pyrofosfater. Derfor er hovedforskjellen mellom Sanger-sekvensering og Pyrosekvensering at Sanger-sekvensering fungerer på sekvensering ved kjedeterminering mens pyrosekvensering fungerer på sekvensering ved syntese.
