Nøkkelforskjell - Microarray vs RNA-sekvensering
Transcriptome representerer hele innholdet av RNA tilstede i en celle inkludert mRNA, rRNA, tRNA, nedbrutt RNA og ikke-nedbrutt RNA. Profilering av transkriptom er en viktig prosess for å forstå celleinnsikten. Det er flere avanserte metoder for transkripsjonsprofilering. Microarray og RNA-sekvensering er to typer teknologier utviklet for å analysere transkriptom. Hovedforskjellen mellom mikroarray og RNA-sekvensering er at microarray er basert på hybridiseringspotensialet til forhåndsdesignede merkede prober med mål-cDNA-sekvenser, mens RNA-sekvensering er basert på direkte sekvensering av cDNA-tråder ved avanserte sekvenseringsteknikker som NGS. Microarray utføres med forkunnskap om sekvensene og RNA-sekvensering utføres uten forkunnskap om sekvenser.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er mikroarray
3. Hva er RNA-sekvensering
4. Sammenligning side om side - Microarray vs RNA-sekvensering
5. Sammendrag
Hva er Microarray?
Microarray er en robust, pålitelig og høy gjennomstrømningsmetode som brukes til transkripsjonsprofilering av forskere. Det er den mest populære tilnærmingen for transkripsjonsanalyse. Det er en rimelig metode, som avhenger av hybridiseringssondene.
Teknikken starter med ekstraksjon av mRNA fra prøven og konstruksjon av cDNA-bibliotek fra totalt RNA. Deretter blandes det med fluorescensmerket forhåndsdesignede sonder på en solid overflate (punktmatrise). Utfyllende sekvenser hybridiserer med de merkede sonder i mikroarray. Deretter vaskes og screenes mikroarray, og bildet kvantifiseres. Innsamlede data bør analyseres for å få de relative uttrykksprofilene.
Intensiteten til mikroarray-sonder antas å være proporsjonal med mengden transkripsjoner i prøven. Imidlertid avhenger nøyaktigheten av teknikken av de utformede sonder, forkunnskaper om sekvensen og affiniteten til sonder for hybridisering. Derfor har mikroarray-teknologi begrensninger. Microarray-teknikk kan ikke utføres med transkripsjoner med lav overflod. Det klarer ikke å skille isoformer og identifisere genetiske varianter. Siden denne metoden er avhengig av hybridisering av prober, forekommer noen problemer relatert til hybridisering som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering etc. i mikroarrayteknikk.
Figur 01: Microarray
Hva er RNA-sekvensering?
RNA hagle sekvensering (RNA seq) er en nylig utviklet hel transkriptomsekvenseringsteknikk. Det er en rask og høy gjennomstrømningsmetode for transkripsjonsprofilering. Det kvantifiserer direkte uttrykk for gener og resulterer i dyp undersøkelse av transkriptomet. RNA seq avhenger ikke av forhåndsdesignerte sonder eller forkunnskaper om sekvensene. Derfor har RNA seq-metoden høy følsomhet og evne til å oppdage nye gener og genetiske varianter.
RNA-sekvenseringsmetode utføres via flere trinn. Total RNA i cellen må isoleres og fragmenteres. Deretter må et cDNA-bibliotek utarbeides ved hjelp av revers transkriptase. Hver cDNA-streng må ligeres med adaptere. Deretter må de ligerte fragmentene amplifiseres og renses. Til slutt ved å bruke en NGS-metode, må sekvensering av cDNA utføres.
Figur 02: RNA-sekvensering
Hva er forskjellen mellom Microarray og RNA-sekvensering?
Diff Article Middle before Table
Microarray vs RNA-sekvensering |
|
| Microarray er en robust, pålitelig og høy gjennomstrømningsmetode. | RNA-sekvensering er en nøyaktig og høy gjennomstrømningsmetode. |
| Koste | |
| Dette er en rimelig metode. | Dette er en kostbar metode. |
| Analyse av et stort antall prøver | |
| Dette gjør det lettere å analysere et stort antall prøver samtidig. | Dette gjør det lettere å analysere et stort antall prøver. |
| Dataanalyse | |
| Dataanalyse er kompleks. | Flere data genereres i denne metoden; dermed er prosessen mer kompleks. |
| Forutgående kunnskap om sekvenser | |
| Denne metoden er basert på hybridiseringsprober, slik at forkunnskaper om sekvenser kreves. | Denne metoden avhenger ikke av tidligere sekvens kunnskap. |
| Strukturelle variasjoner og nye gener | |
| Denne metoden kan ikke oppdage strukturelle variasjoner og nye gener. | Denne metoden kan oppdage strukturelle variasjoner som genfusjon, alternativ spleising og nye gener. |
| Følsomhet | |
| Dette kan ikke oppdage forskjeller i uttrykk for isoformer, så dette har begrenset følsomhet. | Dette har høy følsomhet. |
| Utfall | |
| Dette kan bare resultere i relative uttrykksnivåer. Dette gir ikke absolutt kvantifisering av genuttrykk. | Det gir absolutte og relative uttrykksnivåer. |
| Data omanalyse | |
| Dette må kjøres på nytt for å analysere på nytt. | Sekvenseringsdata kan analyseres på nytt. |
| Behov for spesifikt personell og infrastruktur | |
| Spesifikk infrastruktur og personell er ikke nødvendig for mikroarray. | Spesifikk infrastruktur og personell som kreves av RNA-sekvensering. |
| Tekniske problemer | |
| Microarray-teknikken har tekniske problemer som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering, begrenset påvisningshastighet for individuelle sonder osv. | RNA seq-teknikk unngår tekniske problemer som krysshybridisering, uspesifikk hybridisering, begrenset påvisningshastighet for individuelle sonder osv. |
| Skjevheter | |
| Dette er en partisk metode siden den avhenger av hybridisering. | Bias er lav sammenlignet med mikroarray. |
Sammendrag - Microarray vs RNA-sekvensering
Microarray- og RNA-sekvenseringsmetoder er plattformer med høy gjennomstrømning utviklet for transkriptomprofilering. Begge metodene gir resultater som er sterkt korrelert med genekspresjonsprofiler. Imidlertid har RNA-sekvensering fordeler i forhold til mikroarray for genekspresjonsanalyse. RNA-sekvensering er en mer sensitiv metode for påvisning av transkripsjoner med lav overflod enn mikroarray. RNA-sekvensering muliggjør også differensiering mellom isoformer og identifisering av genvarianter. Imidlertid er microarray det vanlige valget for de fleste forskere siden RNA-sekvensering er en ny og kostbar teknikk med datalagringsutfordringer og kompleks dataanalyse.
