Nøkkelforskjell - SYBR Green vs Taqman
SYBR Green og Taqman er to metoder som brukes til å oppdage eller se amplifikasjonsprosessen av sanntids PCR. SYBR Green er en metode basert på intercalating nukleinsyre farging fargestoff mens Taqman er en metode basert på hydrolysesonde. Begge teknologiene er designet for å generere fluorescens under PCR, som gjør at PCR-maskinen i sanntid kan overvåke reaksjonen i "sanntid". SYBR Green-metoden utføres ved bruk av et fluorescerende fargestoff kalt SYBR green og oppdager amplifiseringen ved å binde fargestoffet til produsert dobbeltstrenget DNA. Taqman utføres ved bruk av dobbeltmerkede sonder og oppdager amplifisering ved nedbrytning av sonden med Taq-polymerase og frigjøring av fluoroforen. Dette er nøkkelforskjellen mellom SYBR Green og Taqman.
INNHOLD
1. Oversikt og
nøkkelforskjell 2. Hva er SYBR Green
3. Hva er Taqman
4. Sammenligning side om side - SYBR Green vs Taqman
5. Sammendrag
Hva er SYBR Green?
SYBR Green er et fluorescerende fargestoff som brukes til å flekke nukleinsyrer, spesielt dobbeltstrenget DNA i molekylærbiologi. SYBR Green-metoden brukes til å kvantifisere PCR-produkter under sanntids-PCR. Når det binder seg med DNA, absorberer det resulterende DNA-fargekomplekset blått lys og avgir sterkt grønt lys. Det skjer på grunn av den strukturelle endringen som oppstår i fargestoffmolekylet ved binding med dobbeltstrenget DNA. Når PCR skaper mer og mer DNA, binder flere fargestoffmolekyler seg med DNA, og genererer mer fluorescens. Derfor øker fluorescensen med akkumuleringen av PCR-produktet. Derfor kan mengden PCR-produkt måles kvantitativt ved SYBR Green-fluorescensdeteksjon.
SYBR grønt fargestoff kan også brukes til DNA-merking i cytometri og fluorescerende mikroskopi. Etidiumbromid er vellykket erstattet av SYBR Green siden Ethidiumbromid er et kreftfremkallende fargestoff med bortskaffelsesproblemer under DNA-visualisering i gelelektroforesen.
Det er fordeler og ulemper ved SYBR grønn metode. Denne metoden er veldig følsom, billig og enkel å bruke. På grunn av sin evne til å binde seg til hvilket som helst dobbeltstrenget DNA, kan ikke-spesifikk binding imidlertid føre til overdimensjonering av PCR-produkt.
Figur 01: SYBR Green Technique
Hva er Taqman?
Taqman er en alternativ metode til SYBR Green for å overvåke sanntids PCR-prosess. Denne metoden avhenger av 5 '- 3' exonukleaseaktiviteten til Taq-polymeraseenzym for å nedbryte probene under utvidelsen av den nye strengen og frigjøring av fluorofor. Dobbel merkede prober brukes i denne metoden, og den er basert på hydrolyse av prober. Sonder er fluorescerende merkede DNA-oligonukleotider som har et fluorescerende reportermolekyl (fluorofor) i 5'-enden og et quencher-molekyl i 3'-enden. De er designet for å binde seg til den enkeltstrengede malen på motsatt side av grunningen. Taq-polymerase tilfører nukleotider til primeren og utvider den nye strengen mot de to merkede sonder. Når Taq-polymerasen møter sonden, aktiveres og nedbryter sonden eksonukleaseaksjon av Taq-polymerasen. Når den har fullført syntesen av den nye strengen, utsettes sonden for fullstendig nedbrytning og frigjør fluoroforen. Frigivelsen av fluorofor genererer fluorescens. Fluorescerende quencher-molekyl slukker effektivt det utsendte lyset og skaper utdata for kvantifisering av PCR-produktet. Utslippet av fluoroforer og mengden av PCR-produktene er proporsjonal. Derfor kan kvantifisering enkelt gjøres ved Taqman-metoden.kvantifisering kan enkelt gjøres ved Taqman-metoden.kvantifisering kan enkelt gjøres ved hjelp av Taqman-metoden.
Figur 02: Taqman-metoden
Taqman-metoden brukes i sanntids PCR, kvantifisering av genuttrykk, påvisning av genetiske polymorfier, kvantifisering av kromosomale DNA-slettinger, bakteriell identifikasjon, verifisering av mikroarrayanalyse, SNP-genotyping etc.
Hva er forskjellen mellom SYBR green og Taqman?
Diff Article Middle before Table
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green er basert på DNA-bindende fargestoff. | Taqman er avhengig av hybridiseringsprober og 5 'til 3' exonukleaseaktivitet av Taq-polymerase. |
| Fluorescensmerket prober | |
| Ingen fluorescerende merkede prober er ikke nødvendig. | Dobbel merkede sonder er påkrevd. |
| Multiplex genanalyse | |
| Det kan ikke brukes til multipleksede genmål. | Den kan brukes til multipleksede genmål. |
| Koste | |
| Dette er billigere. | Dette er dyrere. |
| Spesifisitet | |
| Dette er mindre spesifikt og binder med dobbelt dobbeltstrenget DNA | Disse er svært spesifikke siden prober oppdager de spesifikke amplifikasjonsproduktene. |
| Effektivitet | |
| Dette er mindre effektivt. | Dette er svært effektivt. |
| applikasjon | |
| Dette brukes i sanntid PCR, agarosegel visualisering, DNA merking etc. | Dette brukes i sanntid PCR, kvantifisering av genuttrykk, påvisning av genetiske polymorfier, etc. |
Sammendrag - SYBR Green og Taqman
Taqman og SYBR green er to metoder som brukes i sanntids PCR (kvantitativ PCR). Begge metodene muliggjør kvantifisering av PCR-produktet effektivt og stole på utslipp av fluorescens. Taqman-metoden bruker dobbeltmerkede sonder for påvisning av akkumulert DNA mens SYBR Green-metoden bruker et fluorescerende fargestoff. Begge disse metodene har også forskjellige anvendelser innen molekylærbiologi.
