Hovedforskjellen mellom helicase og topoisomerase er at helicase er et enzym som skiller to komplementære DNA-strenger ved å bryte hydrogenbindinger mellom basene i to tråder mens topoisomerase er et enzym som fjerner positive og negative supercoils dannet under avviklingsprosessen av DNA ved å kutte og forsegle en eller begge strengene av DNA-dupleksen.
DNA er en dobbel helix. Den eksisterer i to komplementære tråder bundet sammen via hydrogenbindinger. DNA-replikering, transkripsjon og DNA-reparasjon krever at to tråder skilles fra hverandre for å lage nye kopier, lage mRNA og legge til nukleotider for å reparere. De to enzymene helicase og topoisomerase spiller inn på dette punktet. Derfor er både helicase og topoisomeraser essensielle i DNA-avvikling. Helicase skiller dobbeltstrenget DNA i enkeltstrenger ved å bryte hydrogenbindinger mellom nukleotidbaseparene i dobbeltstrenget DNA. I motsetning til dette, løser topoisomerase ut DNA-vridningen og avlaster DNA-superspolens natur ved å kutte DNA-fosfat-ryggraden enten i en eller begge tråder.
