Nøkkelforskjell - Northern vs Southern vs Western Blotting
Påvisning av spesifikke sekvenser av DNA, RNA og proteiner er viktig for ulike typer studier innen molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknikk som skiller DNA, RNA og proteiner i henhold til deres størrelse. Fra gelprofilene blir spesiell DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein oppdaget ved spesielle teknikker som kalles blotting og hybridisering med merkede prober. Det er tre forskjellige typer blotting-metoder, nemlig sørlige, nordlige og vestlige. Hovedforskjellen mellom nordlig sørlig og vestlig blotting ligger i typen molekyl det oppdager fra en prøve. Southern blotting er en metode som oppdager en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknikk som oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode som oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve.
INNHOLD
1. Oversikt og nøkkelforskjell
2. Hva er Southern Blotting
3. Hva er Northern Blotting
4. Hva er Western Blotting
5. Sammenligning side om side - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Sammendrag
Hva er Southern Blotting?
Southern blotting-teknikk ble utviklet av EM Southern i 1975 for identifisering av en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blottingteknikken som ble introdusert i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning av spesifikke gener fra DNA, spesifikke fragmenter fra DNA, etc. Det er flere trinn involvert i Southern blotting-teknikken. De er som følger.
- DNA isoleres fra prøven og fordøyes med restriksjonsendonukleaser.
- Fordøyd prøve skilles fra Agarose gelelektroforese.
- DNA-fragmenter i gelen blir denaturert i enkle tråder ved bruk av en alkalisk løsning.
- Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillæroverføring.
- Overført DNA festes permanent på membranen.
- Fast DNA på membranen hybridiseres med merkede prober.
- Ubundet DNA vaskes av membranen ved vask.
- Røntgenfilm blir eksponert for membranen, og en autoradiografi blir fremstilt.
Southern blotting brukes for forskjellige aspekter av molekylærbiologi. Det er nyttig i RFLP-kartlegging, rettsmedisinske studier, DNA-metylering i genekspresjon, påvisning av muterte gener i genetiske lidelser, DNA-fingeravtrykk, etc.
Figur 01: Southern Blotting Technique
Hva er Northern Blotting?
Northern blotting er en metode designet for å oppdage en spesifikk RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for å studere genekspresjon. Denne teknikken ble utviklet av Alwine, Kemp og Stark i 1979. Den skiller seg fra sourthern og western blotting teknikker på grunn av flere trinn. Imidlertid blir denne teknikken også utført via gelelektroforese, blotting og hybridisering med spesifikke merkede sonder og påvisning. Northern blotting-teknikken utføres som følger.
- RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
- RNA overføres fra gelen til en blottingmembran og fikseres.
- Membranen behandles med en merket probe fremstilt fra cDNA eller RNA (sonden er komplementær til en spesifikk sekvens i prøven).
- Sonden inkuberes med membranen for å binde til en spesifikk sekvens.
- Ubundne sonder vaskes av.
- Hybridiserte fragmenter oppdages ved hjelp av en autoradiografi.
Northern blotting er et viktig verktøy i deteksjon og kvantifisering av hybridisert mRNA, studerer RNA-nedbrytning, evaluering av RNA-halveringstid, påvisning av RNA-spleising, studier av genuttrykk, etc.
Figur 02: Northern Blotting
Hva er Western Blotting?
Western blotting er en metode for å påvise et spesifikt protein fra en proteinblanding ved bruk av merket antistoff. Derfor er Western blot også kjent som en immunblot. Denne teknikken ble introdusert av Towbin et al i 1979, og den utføres nå rutinemessig i laboratoriene for proteinanalyse. Fremgangsmåten er som følger.
- Proteiner ekstraheres fra prøven
- Proteiner skilles fra hverandre ved hjelp av polyakrylamidgelelektroforese
- Separerte molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporering
- Membranen er blokkert for uspesifikk binding med antistoffene
- Overførte proteiner er bundet med primært antistoff (enzymmerkede antistoffer).
- Membranen vaskes for å fjerne uspesifikt bundne primære antistoffer
- Bundet antistoffer oppdages ved å tilsette et substrat og oppdage det dannede fargede bunnfallet
Western blotting er nyttig i påvisning av anti-HIV-antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også brukes som en bekreftende test for hepatitt B-infeksjon og endelig test for gale kuesykdommer.
Figur 03: Western Blotting
Hva er forskjellen mellom Northern Southern og Western Blotting?
Diff Article Middle before Table
Northern vs Southern vs Western Blotting |
|
| Type molekyl oppdaget | |
| Northern Blotting | Northern blotting oppdager en spesifikk RNA-sekvens fra en RNA-prøve. |
| Southern Blotting | Southern blotting oppdager en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve. |
| Western Blotting | Western blotting oppdager et spesifikt protein fra en proteinprøve. |
| Type gel | |
| Northern Blotting | Dette bruker Agarose / formaldehydgel. |
| Southern Blotting | Dette bruker en Agarose gel. |
| Western Blotting | Dette bruker polyakrylamidgel. |
| Blotting Metode | |
| Northern Blotting | Dette er en kapillæroverføring. |
| Southern Blotting | Dette er en kapillæroverføring. |
| Western Blotting | Dette er en elektrisk overføring. |
| Sonder brukt | |
| Northern Blotting | cDNA- eller RNA-prober merket radioaktivt eller ikke-radioaktivt. |
| Southern Blotting | DNA-sonder er merket radioaktivt eller ikke-radioaktivt. |
| Western Blotting | Primære antistoffer brukes som sonder. |
| Deteksjonssystem | |
| Northern Blotting | Dette gjøres ved hjelp av en autoradiografi, eller deteksjon av lys eller fargeendring. |
| Southern Blotting | Dette gjøres ved hjelp av en autoradiografi, deteksjon av lys eller fargeendring. |
| Western Blotting | Dette gjøres ved å oppdage lys eller fargeendring. |
Sammendrag - Northern vs Southern vs Western Blotting
Blotting er en spesiell teknikk utviklet for identifisering av spesifikt DNA, RNA eller protein fra prøvene. Det er tre separate blottingprosedyrer, nemlig nordlige, sørlige og vestlige, for å oppdage en bestemt type molekyl. Northern blotting-teknikken er designet for å oppdage en spesifikk RNA-sekvens fra en blanding av RNA. Southern blotting-teknikk muliggjør påvisning av en spesifikk DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting-teknikk er utviklet for å identifisere et spesifikt protein fra en proteinblanding.
